Ларри Дейли провел в Музее естественной истории самую насыщенную ночь в своей жизни и не может забыть о ней, даже оставив работу ночного сторожа и создав собственную фирму по производству рекламных роликов. Дейли словно что-то тянет в музей с оживающей по ночам экспозицией. Зайдя туда, он понимает, что предчувствия его не обманули. Часть его друзей-экспонатов, приобретенных в ту самую ночь, признаны руководством музея устаревшими и отправлены в архив Смитсоновского института в Вашингтоне. Оказавшись в архиве, они потревожили несколько экспонатов, которым спать бы да спать, но кровожадный египетский правитель Хамунра, Наполеон Бонапарт, Иван Грозный и Аль Капоне решили проснуться окончательно, начать действовать и захватить музей с помощью темных сил. Шон Леви, поставивший и первую "Ночь в музее", снова не вышел за рамки безобидной комедии, но кое-что изменил - у Ларри появляются новые друзья, среди которых восковые Альберт Эйнштейн и Авраам Линкольн, у него начнется роман с фигурой Амелии Эрхарт - одной из первых женщин-пилотов, да и размах у фильма, снимавшегося в самом большом музее мира, получился несколько иной. Бен Стиллер, опять играющий главную роль, был рад этому - в детстве он любил ходить в Смитсоновский институт.
Единственное, что слегка омрачало радость Стиллера, - перспектива новой встречи с обезьянками-капуцинами, повредившими ему нос во время съемок первой картины. Но Стиллер нашел неплохую, хотя и несколько неожиданную для мужчины метафору и сам себя подбодрил: "Это как роды. Сперва говоришь себе: "Больше никогда!", а потом забываешь о боли и идешь на это еще раз".